技能介绍

处理从原始计数到可用矩阵的 scRNA-seq 预处理

单细胞 RNA 测序分析的第一步往往决定下游结论的可信度。很多团队直接套用论文或公开流程中的固定阈值，比如“最低基因数 500、线粒体比例 10%”，但实际数据中不同样本、组织或实验方案的细胞状态差异极大——高代谢组织（如肝脏）的线粒体比例可能天然偏高，应激样本的 RNA 降解程度不同，甚至人鼠混样中的线粒体基因命名（^MT- vs ^mt-）都可能导致过滤错误。这类“一刀切”的处理会丢失真实的生物学变异，或在后续聚类中引入技术噪声。

技能的核心能力与关键步骤

该技能围绕 按样本/批次独立预处理 展开，核心流程包括：

输入验证：确认数据是原始整数 UMI 计数（未对数化），去重基因名称并检查细胞条形码唯一性，避免后续 normalize_total() 或 NormalizeData() 对非计数矩阵的误操作。
QC 计算与可视化：优先在每个样本中计算 QC 指标（如 n_genes_by_counts、pct_counts_mt），用分位数或 MAD（中位数绝对偏差）识别离群值，而非合并所有样本后套用全局阈值。
过滤与特殊细胞处理：空液滴识别（如 DropletUtils::EmptyDrops）应在常规 QC 前完成；环境 RNA 校正（SoupX/CellBender/DecontX）需在下游表达分析前执行；双细胞检测（Scruplet/scDblFinder）则安排在常规 QC 过滤后，避免高 ngenesby_counts 仅作为候选线索而非唯一判据。
标准化与高变基因选择：必须在同一 assay 或矩阵上选择一条路线——要么走 LogNormalize 工作流（normalize_total() + log1p() → highly_variable_genes()），要么走 SCTransform 工作流（SCTransform() 内置 HVG 选择），不可串行混用。过滤后需立即保存原始计数（如 Scanpy 的 layers['counts'] 或 Seurat 的 RNA assay counts slot），确保后续需要原始计数的方法（如 seurat_v3 HVG）可用。
回归与缩放：默认不回归 totalcounts 或 pctcounts_mt，除非明确需要去除技术协变量（如细胞周期），且需记录回归前后的 PCA/聚类差异。缩放时优先子集到 HVG，避免在全基因矩阵上进行不必要的稠密化。

适用边界与常见注意点

该技能不提供“一键默认参数”，而是强调 按数据特性调整阈值。例如，snRNA-seq 的基因数和线粒体比例通常低于常规 scRNA-seq，肿瘤或应激样本可能需要放宽线粒体过滤范围；Ensembl ID 或其他物种数据不能假设线粒体前缀，需通过注释表生成布尔向量。此外，回归协变量可能同时移除真实的细胞周期、代谢状态信号，使用前必须对比回归前后的结果并记录理由。完成预处理后，需检查每个样本的细胞数是否合理、QC 指标是否有未处理的极端离群群、双细胞候选率是否与平台装载量匹配，以及 counts layer/raw assay 是否保留完整——这些细节直接影响后续 PCA、聚类或 marker 分析的可重复性。