技能介绍

要解决什么问题

bulk RNA-seq 的差异表达分析依赖负二项模型和原始整数 count，而不是 TPM、FPKM 或 log 变换后的矩阵。实验设计里还常有批次、配对或分组不平衡；若设计矩阵存在完全混杂（例如某条件只出现在某一个 batch），统计上无法区分效应，却很容易被忽略。

本技能面向「已有基因×样本 count 表 + 样本元数据」的场景，把从设计校验到出图、导表的一条链路说清楚，避免用错输入或只看 pvalue 不看 log2FoldChange 的常见坑。

技能如何工作

基于 PyDESeq2（DESeq2 的 Python 实现），按固定步骤推进：

Step 1：检查每组重复数、分组因子 level、批次在各组间是否均衡、是否存在 batch 与 condition 完全重叠等；发现混杂会明确警告并建议调整实验设计。
Step 2：在确认使用 raw count 后拟合 count-aware 模型；可在 design 中纳入 batch 等协变量。
Step 3：按自然语言指定阈值（如 padj、log2FC，或仅用 pvalue）筛选显著差异基因。
Step 4：至少输出 PCA、火山图、MA Plot 三类图，用于样本聚类与效应量/显著性联合判断。
Step 5：导出含 baseMean、log2FoldChange、pvalue、padj 的结果表，以及可用于 GO/KEGG、GSEA、clusterProfiler 等的排序基因列表。

适用边界与注意点

| 重复数 | 建议 |
|--------|------|
| 每组 1 个重复 | 不宜做正式差异分析 |
| 每组 2 个重复 | 可做，结论需保守解读 |
| 每组 ≥3 个重复 | 常规可信流程 |

必需输入为 count 矩阵（CSV/TSV，行基因、列样本）和含分组列（如 condition）的元数据。应同时保留全基因结果表与显著基因子集，并结合 PCA 与火山图检查异常样本与上下调数量是否合理。环境建议：pydeseq2 0.4+、pandas 2.2+ 等（见技能内版本说明）。